اصول فلوسایتومتری در آزمایشگاه ها

اصول فلوسایتومتری در آزمایشگاه ها

روش فلوسایتومتری یک تکنیک تجربی است و برای شمارش و بررسی اندازه، شکل و ویژگیهای سلول های خاص در بین انواع مختلفی از سلول ها به کار میرود. نتایج حاصل از این روش به صورت کمی ارائه میشوند و به وسیله نرم افزارهای خاص تحلیل میشوند.

روش فلوسایتومتری یک تکنیک تجربی است و برای شمارش و بررسی اندازه، شکل و ویژگیهای سلول های خاص در بین انواع مختلفی از سلول ها به کار میرود. نتایج حاصل از این روش به صورت کمی ارائه میشوند و به وسیله نرم افزارهای خاص تحلیل میشوند.
Flow: سلولهای در حال حرکت
Cyto: سلول
Metry: اندازه گیری
 
دستگاه فلوسایتومتر تفرق اشعه لیزر را که از تفرق های جانبی و تفرق های رو به جلو تشکیل شده را تشخیص می دهد. مقدار تفرق های رو به جلوی مربوط به هر سلول توسط آشکارسازها که در امتداد جهت باریکه لیزر قرار دارند، تشخیص داده میشوند. از تفرق های رو به جلو، اندازه سلول محاسبه میشود. تفرق های جانبی نیز ویژگیهایی از سلول را که مربوط به شکل و پیچیدگی های ساختار درونی سلولی میشوند، آشکار می سازند. 
نوری که در مسیر مستقیم تابیده میشود FCS و تابش جانبی را SSC  میگویند.
 
دستگاه فلوسایتومتر از یک سری اجزای کلیدی تشکیل شده که شامل: قسمت عبور نمونه، لیزرها، عدسی های تجمیع کننده نور، آشکارساز های (دتکتور) میزان نور و یک سیستم کامپیوتری جهت جمع آوری داده ها برای بررسی توسط متخصصین.
مهمترین اصل در فلوسایتومتری، بررسی خواص ذرات به صورت انفرادی است. هنگامی که نمونه در دستگاه قرار میگیرد ذرات به صورت تصادفی پراکنده شده و هر ذره به صورت جداگانه از مقابل پرتو لیزر عبور کرده و در سیستم تشخیصی دستگاه قرار میگیرد.
 
شاخصهای FSC و SSC برای هر ذره منحصر به فرد بوده و از مقایسه این دو شاخص، میتوان به منظور تمایز انواع مختلف سلول در یک نمونه هتروژن استفاده کرد. انداز ه گیریهای فلورسانس که در طول موجهای مختلف انجام می شوند، میتوانند اطلاعات کیفی و کمی را در مورد گیرنده های سطح سلول که با فلوروکروم نشاندار شده اند و همچنین مولکولهای درون سلولی مانند DNA و ستیوکینها را در اختیار ما قرار دهند.
 فلوسایتومترها برای تشخیص نوری که تابش شده، از کانالهای فلورسانس مجزا استفاده میکنند. تعداد دتکتورها بر اساس نوع دستگاه و کارخانه سازنده آن متفاوت است.
از این روش در ایمونوفنوتایپینگ، بررسی تومورهای پلوییدی، پتانسیل غشاء، شار یون، زنده ماندن سلولها، رنگ آمیزی پروتئینهای داخل سلولی، تغییرات pH، ردیابی سلول و تکثیر آن، مرتب سازی، ساختار کروماتین، ساختار پروتئین، لیپیدها، همجوشی غشاء، فعالیت آنزیمها، متابولیسم اکسیداتیو، گروه های سولفوریدیل / گلوتاتیون، سنتز DNA، تجزیه DNA، بیان ژن و بررسی آپوپتوز سلولی استفاده میشود. یکی از مهمترین کاربردهای فلوسایتومتری جداسازی سلول ها بر اساس اپی توپ جهت مطالعات بیولوژیکی است. این عمل را آنالیز FACS میگویند.
علاوه بر توانایی های ذکر شده، روش فلوسایتومتری قادر است تا مقدار نور تابیده شده به واسطه مولکول های فلورسنت تحریک شده را آشکار و اندازه گیری کند  .
 پروب های فلورسنت دارای کاربرده ای بسیار گسترد ه ای هستند که میتوان به کاربردهایی از قبیل شناسایی و شمارش دقیق سلو لها، دسته بندی و جداسازی سلولی، تعیین فنوتیپ ایمونولوژیکی سلولی، مشخص کردن محتوای اسید نوکلئیکی سلول و ... اشاره کرد.
 
بررسی انتخابی سلولهای مورد نظر و حذف نتایج مرتبط با سلولهای ناخواسته مانند سلولهای مرده، یکی از مهمترین اصول فلوسایتومتری است. این اصل را Gating مینامند.
آنالیز سلولهای خونی کاملاً لیز شده، مهمترین کاربرد Gating است.
فلوسایتومتر داده های مختلف را به شکل هیستوگرام های تک پارامتری، دو بعدی و نمودارهای نقطه ای به متخصصان ارائه میدهد. 
هیستوگرام های تک پارامتری نمودارهایی هستند که سنجش یک پارامتر را بر روی محور x ها و تعداد فرآیندها یا سلو لهای شمرده شده را بر روی محور y  نشان میدهند.
هسیتوگرامهای دو بعدی، نمودارهایی هستند که دو پارامتر سنجشی را نشان می دهند. در این نوع نمودار محورx  نشانگر یکی از پارامترها و محور y  نشانگر پارامتر دیگر بوده و میزان و تعداد سلو لها، بر اساس تراکم نقاط در نواحی مخصوص به خود بر روی نمودار مشخص خواهند بود. این پارامترها میتوانند FSC ، SSC یا فلورسانس باشند.